Методы исследования генома. Лечение генетических заболеваний за границей. Методы зарубжной генетики

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДНК

1. Для выделения ДНК из гомогената тканей уда­ляют фрагменты клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования. Белки, разрушенные
протеазами (чаще всего применяют протеиназу К), экстрагируют из раствора. Затем ДНК осаждают, на­пример, этанолом и после удаления надосадочной
жидкости ДНК растворяют в буферном растворе.

2. Молекула ДНК среднего размера содержит 150 000 000 нуклеотидных пар и имеет длину 4 см.
Поэтому молекулы ДНК чувствительны к сдвиго­вым усилиям, возникающим в растворе, и в процессе выделения ДНК из тканей она фрагменти-руется. Получаются молекулы ДНК значительно меньше исходных, но все равно очень большие - тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их при­ходится дополнительно фрагментировать.

Для фрагментирования используют рестриктазы - ферменты, выделяемые из бактерий. У бак­терий эти ферменты участвуют в уничтожении чужеродных для них ДНК. Рестриктазы «узнают» специфические последовательности из 4-6 нук­леотидов (сайты рестрикции), которые встреча­ются в ДНК человека. Известно множество раз­личных рестриктаз, причем каждая из них «узнает» свой сайт рестрикции (рис. 3.3).

С помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины. На­пример, для изучения первичной структуры удобны фрагменты размером около 300 нуклеотидных пар н.п. Следовательно, цельную молекулу ДНК в 150 000 000 н.п. нужно разрезать на 500 000 фраг­ментов и каждый из фрагментов изучать отдельно.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для прове­дения некоторых исследований необходимо боль­шое количество хорошо очищенной высокомоле­кулярной ДНК. Метод ПЦР дает возможность избирательно синтезировать in vitro небольшие уча­стки ДНК и получить за 3-4 ч несколько миллио­нов копий исследуемого фрагмента. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды и т.д. Подробно этот метод и его применение в ДНК-диагностике будут рассмотрены в теме 3.10.

Гибридизация. Для изучения видовой специфично­сти нуклеиновых кислот применяют метод гибриди­зации. Он основан на способности ДНК к денатура­ции при нагревании (80-90 °С) и ренативации при последующем охлаждении. Возможно использова­ние метода для проведения гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Методом гибридизации можно установить сход­ство и различия первичной структуры разных об­разцов нуклеиновых кислот.

Секвенирование генома.

Секвенирование генома здорового человека в большинстве случаев не способно предсказать развитие у него в будущем тех или иных заболеваний. Результаты этой работы были представлены на Ежегодной встрече Американской Ассоциации по исследованию рака (Association for Cancer Research), а также опубликованы в журнале Science Translational Medicine .

Полное секвенирование генома представляет собой «каталогизирование» всех генов, полученных человеком от обоих родителей, и их проверку на наличие повреждений ДНК, которые могли бы повысить восприимчивость человека к раку и иным заболеваниям. Поскольку стоимость секвенирования генома постоянно снижается (в настоящее время цена процедуры составляет 1-3 тысячи долларов США), многие здоровые люди начали задумываться над тем, чтобы пройти такое обследование и определить для себя риск развития того или иного заболевания. Однако исследователи из Центра по изучению рака Johns Hopkins Kimmel призывают их не торопиться.

Выводы ученых вовсе не означают, что секвенирование генома не имеет никакой медицинской ценности. «Во-первых, секвенирование генома остается лучшим средством для предсказания „семейных“ заболеваний, таких как рак и некоторые другие, - говорит профессор онкологии Берт Фогельштайн (Bert Vogelstein). - Во-вторых, детальное изучение генома индивидуума помогает лучше понять механизм уже протекающего у него заболевания и точнее подобрать для него индивидуальную терапию. Однако в случае со здоровым человеком геном перестает быть надежным предсказателем».

Исследователи проследили развитие 24 заболеваний у более чем 50 тысяч близнецов из 5 стран, прошедших процедуру секвенирования генома. Результаты показали, что в случае 23 заболеваний анализ генома дал отрицательный результат и отнес риск их развития к разряду «низкий». Однако, по словам профессора Фогельштайна, это вовсе не означает, что данное заболевание у данного человека не разовьется. «Это означает всего лишь, что его персональный риск немного ниже, чем средний риск по популяции, который может быть очень существенным, - говорит исследователь. - Таким образом, даже негативный результат не гарантирует отсутствия заболевания в будущем». При этом риск 4 из 24 заболеваний- заболевания сердца у мужчин, аутоиммунный тиреоидит, диабет I типа и болезнь Альцгеймера - устойчиво определялся в ¾ случаев, что позволяет назвать секвенирование генома достаточно надежным средством определения предрасположенности к этим болезням.

Современная геномика.

Длительное время геномом называли гаплоидный набор хромосом. Накопление сведений об информационной роли внехромосомной ДНК изменило определение термина «геном». В настоящее время он означает полный состав ДНК клетки, т.е. совокупность всех генов и межгенных участков. Можно считать, что геном - полный набор инструкций для формирования и функционирования индивида.

Общие принципы построения геномов и их структурно-функциональную организацию изучает геномика, которая проводит секвенирование, картирование и идентификацию функций генов и внегенных элементов. Методы геномики направлены на расшифровку новых закономерностей биологических систем и процессов. Геномика человека является основой молекулярной медицины и имеет важнейшее значение для разработки методов диагностики, лечения и профилактики наследственных и ненаследственных болезней. Для медицины первостепенное значение имеют исследования в области геномики патогенных микроорганизмов, поскольку они проливают свет на природу инфекционного процесса и создание лекарств, направленных на специфические мишени бактерий.

Геномика, несмотря на её «молодой возраст», подразделяется на несколько почти самостоятельных направлений: структурную, функциональную, сравнительную, эволюционную, медицинскую геномику.

Структурная геномика изучает последовательность нуклеотидов в геномах, определяет границы и строение генов, межгенных участков и других структурных генетических элементов (промоторов, энхансеров и т.д.), т.е. составляет генетические, физические и транскриптные карты организма.

Функциональная геномика. Исследования в области функциональной гено-мики направлены на идентификацию функций каждого гена и участка генома, их взаимодействие в клеточной системе. Очевидно, это будет осуществляться путём изучения белковых ансамблей в разных клетках. Эту область исследований называют протеомикой.

Сравнительная геномика изучает сходства и различия в организации геномов разных организмов с целью выяснения общих закономерностей их строения и функционирования.

Эволюционная геномика объясняет пути эволюции геномов, происхождение генетического полиморфизма и биоразнообразия, роль горизонтального переноса генов. Эволюционный подход к изучению генома человека позволяет проследить за длительностью формирования комплексов генов, отдельных хромосом, стабильностью его частей, недавно обнаруженными элементами «непостоянства» генома, процессом расообразования, эволюцией наследственной патологии.

Медицинская геномика решает прикладные вопросы клинической и профилактической медицины на основе знания геномов человека и патогенных организмов (например, диагностика наследственных болезней, генотерапия, причины вирулентности болезнетворных микроорганизмов и т.д.).

Все шаги эволюции живой природы, несомненно, должны были закрепляться в информационной системе ДНК (а для некоторых существ - в РНК), а также в организации её в клетке для выполнения консервативной функции сохранения наследственности и противоположной функции - поддержания изменчивости. Такое представление о формировании генома каждого вида наиболее обоснованно. Применительно к геному человека можно сказать, что эволюция человека - это эволюция генома. Такое представление подтверждается теперь многочисленными молекулярно-генетическими исследованиями, поскольку стало возможным сопоставление геномов разных видов млекопитающих, в том числе человекообразных обезьян, а также в пределах вида Homo sapiens геномов разных рас, этносов, популяций человека и отдельных индивидов.

Организация генома каждого эукариотического вида представляет собой последовательную иерархию элементов: нуклеотидов, кодонов, доменов, генов с межгенными участками, сложных генов, плеч хромосом, хромосом, гаплоидного набора вместе с внехромосомной и внеядерной ДНК. В эволюционном преобразовании генома каждый из этих иерархических уровней мог вести себя совершенно дискретно (изменяясь, комбинируясь с другими и т.д.).

Наши представления о геноме человека - обширная область генетики человека, включающая по меньшей мере понятия «инвентаризации» генов, групп сцепления, картирования генов (локализация), секвенирования всей ДНК (генов, их мутаций и хромосом в целом), мейотических преобразований, функционирования отдельных генов и их взаимодействий, интеграции структуры и функции генома в целом. На решении всех этих вопросов была сосредоточена обширная многолетняя международная программа «Геном человека» (с 1990 по 2000 г.). Главным направлением работ были последовательное секвенирование участков генома и их «состыковка». Успешные разработки в этой области придали программе клинико-генетический аспект.

Клинические приложения сведений о геноме человека

Систематическое изучение генома человека фактически началось с применения менделевского анализа наследственных признаков человека (начало XX века). Генеалогический метод вошел тогда в широкую практику, и шаг за шагом стал накапливаться материал по «инвентаризации» дискретных наследственных признаков человека, но этот процесс постепенно замедлялся (за 50 лет было открыто не более 400 менделирующих признаков и 4 группы сцепления), возможности клинико-генеалогического метода в чистом виде были исчерпаны.

Бурный прогресс цитогенетики человека, биохимической генетики и особенно генетики соматических клеток в 60-х годах в комплексе с генеалогическим подходом поставил изучение генома человека на новые теоретические основы и высокий методический уровень. Обнаружение новых менделирующих признаков человека стало быстро продвигаться, особенно на биохимическом и иммунологическом уровне, появились возможности изучения сцепления и локализации генов.

Особый импульс изучению генома человека придали молекулярно-генетические методы, или технология генной инженерии (70-е годы). Процесс познания генома углубился до выделения гена в чистом виде и его секвенирования.

В отличие от классической, в новой генетике изменился подход к анализу генов. В классической генетике последовательность была следующей: идентификация менделирующего признака -> локализация гена в хромосоме (или группе сцепления) -> первичный продукт гена -> ген. В современной генетике стал возможным и обратный подход: выделение гена -> секвенирование -> первичный продукт, в связи с чем был введён новый термин для определения такого направления исследований: «обратная генетика» или «генетика наоборот».

Продолжаются совершенствование молекулярно-генетических методов и, что не менее важно, их автоматизация. В США и Великобритании были разработаны и внедрены автоматические приборы по секвенированию геномов. Их назвали геномотронами. В них осуществляется до 100 000 полимеразных реакций в час. Это означает, что в течение недели может быть просеквенирован участок (или участки) длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов.

Большую роль в расшифровке генома человека играют вычислительная техника и информационные системы. Благодаря им решаются вопросы накопления информации (базы данных) из разных источников, хранения её и оперативного использования исследователями из разных стран.

5710 0

Существует точка зрения, которую разделяет немалое число специалистов, что все заболевания человека за исключением травм связаны с генетическими дефектами. Очевидно, это крайняя точка зрения, тем не менее она отражает важность генетических факторов в определении состоянии здоровья людей. Генетические дефекты бывают разной значимости и состояния.

Хотя обычно считают диабет и мышечную дистрофию заболеванием, а расщепление неба или цветовую слепоту - наследственными дефектами - все это является результатом мутаций в генетическом материале. Показано также, что предрасположенность к заболеванию также зависит от генетической конституции.

Генетические дефекты или мутации в последовательности ДНК выражаются в замене одного нуклеотида другим, потере целого фрагмента или его переносе на другое положение в геноме и пр. Такие изменения могут привести к изменениям структуры (и функции) белка, который кодируется данным фрагментом ДНК или к изменению регуляторных участков генов, гибельным для клеток. Говоря о наследственных заболеваниях, мы имеем в виду мутации, которые появляются в половых клетках и передаются потомству.

В соматических клетках на протяжении жизни также накапливаются мутации, которые могут стать причиной заболевания, но они по наследству не передаются. Ранее считалось, что все мутации вредны. Это связано с тем, что именно с таких мутаций, вызывающих заболевания, было начато изучение генетических характеристик человека. Но сейчас, когда прочитан практически весь нуклеотидный текст человека, стало ясно, что большая часть мутаций является нейтральной. Вредные мутации, приводящие к грубому нарушению развития организма, отсеиваются отбором - их носители не выживают или не дают потомства.

Огромный прорыв в понимании, как унаследованные гены влияют на физические и психологические особенности человека, произошел за последние десятилетия благодаря открытиям, сделанным при исследовании генома человека. Установлены и диагностируются как целый ряд генетических заболеваний, так и предрасположенность к ним, причем на самых ранних этапах развития эмбриона. Большие надежды на расширение возможностей современной медицины связаны с реализацией проекта «Геном человека».

Реализация научного проекта «Геном человека»

Научный проект «Геном человека» - это международная программа, конечной целью которой являлось определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) всей геномной ДНК человека, а также идентификация генов и их локализация в геноме (картирование). В 1988 г. Министерство энергетики США и Национальный институт здоровья США представили обширный проект, в задачи которого входило секвенирование геномов человека, а также бактерий, дрожжей, нематоды, плодовой мушки и мыши - организмов, которые широко использовались в качестве модельных систем в изучении генетики человека.

На реализацию этого проекта Конгресс выделил 3 млрд дол. (по одному доллару за каждый нуклеотид человеческого генома). Директором проекта был назначен лауреат Нобелевской премии Джеймс Уотсон. К проекту присоединились другие страны - Англия, Франция, Япония и др.

В 1989 г. по инициативе академика А.А. Баева в нашей стране был организован научный совет по программе «Геном человека». В 1990 г. была создана Международная организация по изучению генома человека (HUGO), вице-президентом которой в течение нескольких лет был академик А.Д. Мирза-беков. Независимо от вклада и государственной принадлежности отдельных участников программы с самого ее начала вся получаемая ими в ходе работ информация была открыта и доступна для всех его участников.

Двадцать три хромосомы человека были поделены между странами-участницами. Российские ученые должны были исследовать структуры 3-й и 19-й хромосом. Однако вскоре финансирование работ по этому проекту было сильно сокращено, и реального участия в секвенировании наша страна не принимала. Тем не менее работы по геномному проекту в нашей стране не прекратились: программа была пересмотрена и сконцентрирована на развитии биоинформатики -математических методов, вычислительной техники, программного обеспечения, совершенствовании способов описания и храненеия геномной информации, которые бы помогли понять и осмыслить расшифрованную информацию.

На расшифровку генома человека было отведено 15 лет. Однако постоянное развитие технологии секвенирования позволило завершить проект на 2 года раньше. Немалую роль в интенсификации работ сыграла частная американская компания Celera, возглавляемая Дж. Вентером (в прошлом - биолог Национального института здоровья США). Если в начальные годы осуществления проекта по всему миру секвенировали несколько миллионов нуклеотидных пар в год, то в конце 1999 г. Celera расшифровывала не менее 10 млн нуклеотидных пар в сутки. Для этого работы велись круглосуточно в автоматическом режиме 250 роботизированными установками, информация сразу же передавалась в банки данных, где систематизировалась, аннотировалась и выкладывалась в Интернет.

При проведении работ в 1995 г. Вентер с соавторами разработал и опубликовал совершенно новый подход к секвенированию генома, названный методом произвольного секвенирования полного генома (более известный как произвольное секвенирование методом дробления), который позволял собрать полный геном из частично секвенированных фрагментов ДНК при помощи компьютерной модели.

Этим методом впервые был полностью секвенирован геном самореплицирующегося свободно живущего организма - бактерии Haemophilus in-fluenzae Rd. Копии ДНК бактерии были разрезаны на куски произвольной длины от 200 до 1 600 п.о. Эти фрагменты секвенировали по несколько сот с каждого конца. Кроме того, были секвенированы и более длинные фрагменты по 15-20 тыс. п.о. Полученные последовательности были внесены в компьютер, который их сравнивал, распределял по группам и по сходству.

Первыми идентифицировались неповторяющиеся последовательности, затем -повторяющиеся последовательности фрагментов. Длинные фрагменты помогали установить порядок часто повторяющихся, почти идентичных последовательностей. Затем заполнялись пробелы между полученными основными кусками ДНК. Секвенирование генома Haemophilus influenzae заняло один год и при этом была определена последовательность 1 830 137 п.о. и 1 749 генов, расположенных на 24 304 фрагментах.

Это был несомненный успех, который доказал, что новая технология может быть применима для быстрого и точного секвенирования целых геномов. В 1996 г. картировали геном первой эукариотической клетки - дрожжевой, а в 1998 впервые секвенировали геном многоклеточного организма - круглого земляного червя Caenorhabolits elegans.

В феврале 2001 г. рабочий вариант генома человека (выполненный на 90 %) был одновременно опубликован в журналах «Nature» - результаты HUGO и «Science» - результаты исследований компании Celera. Анализ полученного варианта генома человека выявил около 25 тыс. генов. Ранее предполагалось, что это количество должно достигать 140 тыс. (если исходить из постулата «один ген кодирует один белок»). В настоящее время представляется возможным, что один ген может кодировать 5-6 белков. Многообразие белков, кодируемых одним и тем же геном, обеспечивается несколькими механизмами: с помощью альтернативного сплайсинга, посттрансляционных превращений белков - фосфорилирования, ацетилирования, метилирования, гликозилирования и многих других.

В 2003 г. был опубликован окончательный вариант полной последовательности генома человека. Вся эта информация является доступной и находится в Интернете на нескольких сайтах. Однако до сих пор некоторые элементы генома не поддаются секвенированию современными технологиями, а наши знания о геноме остаются неполными. Оказалось, что лишь 30 % генома кодируют белки и участвуют в регуляции действия генов.

Каковы функции остальных участков генома и есть ли они вообще, остается совершенно неясным. Около 10 % генома составляют так называемые Alu-элементы длиной около 300 п.о. Они появились неизвестно откуда в ходе эволюции только у приматов. Попав к человеку, они размножились до полумиллиона копий и распределились по хромосомам самым причудливым образом.

Что касается кодирующих участков ДНК, то при чисто молекулярно-компьютерном анализе они были названы генами по сугубо формальным критериям: наличию знаков пунктуации, необходимых для прочтения информации и синтеза конкретного генного продукта. При этом время и действие большинства потенциальных генов пока неясны, и для определения их функций может потребоваться не меньше ста лет.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

25 апреля теперь уже далекого 1953 г. журнал Nature опубликовал небольшое письмо молодых и никому неизвестных Ф.Крика и Дж.Уотсона редактору журнала, которое начиналось словами: «Мы хотели бы предложить свои соображения по поводу структуры соли ДНК. Эта структура имеет новые свойства, которые представляют большой биологический интерес». Статья содержала около 900 слов, но – и это не преувеличение – каждое из них было на вес золота.

«Ершистая молодежь» посмела выступить против нобелевского лауреата Лайнуса Полинга, автора знаменитой альфа-спирали белков. Полинг буквально накануне опубликовал статью, согласно которой ДНК представляла собой трехцепочечную спиральную структуру, наподобие девичьей косы. Тогда никто не знал, что у Полинга был просто недостаточно очищенный материал. Но и Полинг оказался отчасти прав – сейчас трехцепочечность некоторых участков наших генов хорошо известна. Это свойство ДНК даже пытались одно время использовать в борьбе с раком, выключая с помощью олигонуклеотидов те или иные раковые гены (онкогены).

Биологии нуклеиновых кислот долго не везло. Достаточно сказать, что первую нобелевскую премию за открытие строения нуклеотидов немец А.Коссель получил еще в 1910 г. А знаменитая реакция Фельгена для окрашивания ДНК была предложена накануне Первой мировой войны и усовершенствована в 1920-е гг. Тогда и могла бы начаться новая эра биологии, однако...

Однако биологи были уверены, что «монотонная» ДНК с ее только четырьмя различающимися основаниями просто не могла нести генетическую информацию о миллионах самых разнообразных белков. И хотя уже применялась азбука Морзе с тремя кодирующими элементами, менталитет исследователей еще не достиг уровня информационной эры с ее двоичной системой записи («0» и «1») любой информации.

Лишь к началу 1950-х гг. отдельные ученые стали обращать внимание на ДНК, роль которой в передаче наследственных признаков у микроорганизмов установил в 1943 г. Освальд Эйвери. Результатам Эйвери поверил Сальвадор Лурия, который вместе с Максом Дельбрюком организовал неподалеку от Нью-Йорка лабораторию на биостанции в местечке Колд-Спринг Харбор.

Заметим в скобках, что физик М.Дельбрюк был учеником Н.В. Тимофеева-Ресовского в биологии и соавтором их совместной с К.Циммером знаменитой статьи, посвященной определению размеров гена. Лурия с Дельбрюком изучали жизненный цикл бактериофагов – вирусов микроорганизмов, в результате чего и пришли к предположениям о биологической роли ДНК. Лурия послал своего аспиранта Джеймса Уотсона в Кавендишскую лабораторию в Кембридже, где Морис Уилкинс и Розалинд Франклин исследовали строение ДНК с помощью рентгена (англичане лидировали в рентгеноструктурном анализе биомолекул).

В лаборатории Уилкинса работал также еще довольно молодой физик Фрэнсис Крик, известный в узких лабораторных кругах своим научным скепсисом: для него просто не существовало никаких авторитетов, чем он и заработал себе репутацию скандалиста. Статью Полинга в лабораторию принес его сын, который помог, кстати, Уотсону и Крику уяснить роль попарного комплементарного соединения азотистых оснований. Статья стала последней каплей перед озарением, или пониманием... тем, что оформилось в открытие молодых ученых.

Научное сообщество, однако, не сразу признало их открытие. Достаточно сказать, что сначала Нобелевскую премию за работы в области ДНК «судьи» из Стокгольма присудили в 1959 г. известным американским биохимикам Северо Очоа и Артуру Корнбергу. Очоа был первым (1955), кто сумел синтезировать рибонуклеиновую кислоту (РНК). Корнберг же получил премию за синтез ДНК в пробирке (1956).

В 1962 г. настал черед Крика, Уотсона и Уилкинса. Р.Франклин к тому времени уже умерла от рака в возрасте 37 лет, иначе это был бы единственный случай в истории Нобелевских премий, когда награду вручили бы четверым, хотя это и не допускается уставом. Вклад Франклин в развитие рентгеноструктурного анализа ДНК был просто неоценим.

После открытия Уотсона и Крика важнейшей проблемой стало выявление соответствия между первичными структурами ДНК и белков. Поскольку в составе белков обнаруживается 20 аминокислот, а нуклеиновых оснований всего 4, то для записи информации о последовательности аминокислот в полинуклеотидах необходимо не менее трех оснований. На основании таких общих рассуждений варианты «трехбуквенных» генетических кодов предложили физик Г.Гамов и биолог А.Нейфах. Однако их гипотезы были чисто умозрительными и не вызвали большого отклика среди ученых.

Трехбуквенный генетический код к 1964 г. расшифровал Ф.Крик. Вряд ли он тогда предполагал, что в обозримом будущем станет возможной расшифровка генома человека. Эта задача долгое время казалась неразрешимой. Однако два открытия позволили сдвинуть проблему с места.

В 1970 г. не известные широкой научной общественности Г.Темин и Д.Балтимор опубликовали в Nature статьи, посвященные обратной транскриптазе (ОТ) – ферменту РНК-содержащих, в том числе раковых, вирусов, которые синтезируют ДНК на матрице РНК, т.е. осуществляют реакцию, обратную той, которую до тех пор наблюдали в клетках.

Открытие обратной транскриптазы позволило выделить первые гены. Но процесс этот был крайне трудоемким и чрезвычайно дорогим. А спустя 15 лет некий химик из Калифорнии предложил на суд коллег уникальную полимеразную цепную реакцию (ПЦР), сразу же ставшую знаменитой. В этой реакции фермент, полимераза, «ходит как челнок» по фрагменту ДНК, поэтому ПЦР позволяет нарабатывать любые количества этого фрагмента, необходимые для анализа*.

ПЦР, а также появление новейшей электронной техники и компьютеров сделали вполне реальной задачу расшифровки всего генома человека. Долгие дебаты закончились в конце сентября 1988 г., когда во главе проекта HUGO – Организации по расшифровке генома человека – был поставлен Дж.Уотсон.

Журнал Time назвал в связи с этим Уотсона «охотником за генами». Сам же ученый сказал следующее: «Это захватывающая перспектива. Тридцать лет назад мы не могли и мечтать о том, чтобы узнать структуру генома даже мельчайшего вируса. А сегодня мы уже расшифровали геном вируса СПИДа и почти полностью прочитали геном кишечной палочки объемом в 4,5 млн букв ген-кода. Точное знание детальной структуры генома человека – это восхитительно!».

И вот геном прочитан
Завершение работ по расшифровке генома человека консорциумом ученых планировалось к 2003 г. – 50-летию открытия структуры ДНК. Однако конкуренция сказала свое слово и в этой области.

Крейг Вентер основал частную компанию «Селера», которая продает генные последовательности за большие деньги. Включившись в гонку по расшифровке генома, она за один год сделала то, на что у международного консорциума ученых из разных стран ушло десять лет. Это стало возможным благодаря новому методу чтения генетических последовательностей и использованию автоматизации процесса чтения.

Итак, геном прочитан. Казалось бы, надо радоваться, но ученые пришли в недоумение: уж очень мало генов оказалось у человека – примерно в три раза меньше, чем ожидалось. Раньше думали, что генов у нас около 100 тыс., а на самом деле их оказалось около 35 тыс. Но даже не это самое главное.

Недоумение ученых понятно: у дрозофилы 13 601 ген, у круглого почвенного червя – 19 тыс., у горчицы – 25 тыс. генов. Столь малое количество генов у человека не позволяет выделить его из животного царства и считать «венцом» творения.

Зато там, где располагаются гены, активность ДНК и ферментов, синтезирующих ее копии в виде молекул информационной РНК, повышается в 200–800 раз! Это – «горячие точки» генома.

В геноме человека ученые насчитали 223 гена, которые сходны с генами кишечной палочки. Кишечная палочка возникла примерно 3 млрд лет назад. Зачем нам такие «древние» гены? Видимо, современные организмы унаследовали от предков какие-то фундаментальные структурные свойства клеток и биохимические реакции, для которых необходимы соответствующие белки.

Нет поэтому ничего удивительного и в том, что половина белков млекопитающих имеют сходство аминокислотных последовательностей с белками мухи дрозофилы. В конце концов мы дышим одним и тем же воздухом и потребляем животные и растительные белки, состоящие из одних и тех же аминокислот.

Удивительно, что с мышью мы имеем 90% общих генов, а с шимпанзе – вообще 99%!

В нашем геноме много последовательностей, доставшихся нам в «наследство» от ретровирусов. Эти вирусы, к которым относятся вирусы рака и СПИДа, вместо ДНК в качестве наследственного материала содержат РНК. Особенностью ретровирусов является, как уже говорилось, наличие обратной транскриптазы. После синтеза ДНК по РНК вируса вирусный геном встраивается в ДНК хромосом клетки.

Таких ретровирусных последовательностей у нас много. Время от времени они «вырываются» на волю, в результате чего возникает рак (но рак в полном соответствии с законом Менделя проявляется лишь у рецессивных гомозигот, т.е. не более чем в 25% случаев). Совсем недавно было сделано открытие, которое позволяет понять не только механизм встраивания вирусов, но и назначение некодирующих последовательностей ДНК. Оказалось, что для встраивания вируса необходима специфическая последовательность из 14 букв генетического кода. Таким образом, можно надеяться, что вскоре ученые научатся не только блокировать агрессивные ретровирусы, но и целенаправленно «внедрять» нужные гены, и генотерапия из мечты превратится в реальность.

В организме млекопитающих ретровирусы играют и еще одну немаловажную роль. В отношении млекопитающих, у которых плод развивается внутри организма матери, правомерен вопрос: почему иммунная система матери позволяет развиваться организму, который наполовину генетически ей чужероден, поскольку половина генома плода отцовская?

Все дело в ретровирусах, которые блокируют активность иммунных Т-лимфоцитов, ответственных за отторжение органов и тканей, содержащих чужеродные белки, например, после трансплантации органов. Эти ретровирусы активируются в геноме клеток плаценты, которая образуется тканями плода.

Недавно был обнаружен вирус, который блокирует развитие (экспрессию) ретровируса. Если этим вирусом-блокатором заразить беременную мышь, то мышата рождаются нормальными и в срок. Но если его ввести в клетки плаценты, то происходит выкидыш плода, так как активируются Т-лимфоциты матери.

Не стоит забывать, что ретровирусные последовательности возникают также непосредственно на концах хромосом – теломерах. Как известно, теломеры состоят из одноцепочечной ДНК, которая синтезируется ферментом теломеразой по матрице РНК. Считается, что теломеры являются нашими молекулярными часами, поскольку они укорачиваются с каждым клеточным делением. Раньше считалось, что в теломерах нет генов, однако расшифровка генома показала, что генов там довольно много и они активны в детстве и молодом возрасте, постепенно «угасая» по мере старения организма.

Не так уж бездеятельны и тандемные повторы. В норме они имеют определенное число повторяющихся троек, пятерок и даже семерок букв. Но в некоторых случаях в результате мутаций число повторов начинает нарастать, что ведет к нестабильности генома. Дело доходит даже до «поломок» концов хромосом. Фрагментация концевых участков хромосомы может привести к перемещениям (транслокации) участков ДНК в другую хромосому, а также синтезу таких форм белка, которые вызывают гибель нервных клеток, как это наблюдается при наследственной хорее Гентингтона.

К.Вентер говорил, что понимание генома потребует сотни лет. Ведь мы до сих пор не знаем функций и роли более чем 25 тыс. генов. И даже не знаем, как подступиться к решению этой задачи, поскольку большинство генов просто «молчит» в геноме, никак себя не проявляя.

Следует учитывать, что в геноме накопилось множество псевдогенов и генов-«перевертышей», которые также неактивны. Похоже, что некодирующие последовательности являются как бы изолятором активных генов. В то же время, хотя генов у нас и не слишком много, они обеспечивают синтез до 1 млн (!) самых разных белков. Как же это достигается при таком ограниченном наборе генов.

Как оказалось, в нашем геноме существует специальный механизм – альтернативный сплайсинг. Заключается он в следующеем. На матрице одной и той же ДНК происходит синтез разных альтернативных и-РНК. Сплайсинг и означает «расщепление», когда образуются разные молекулы РНК, которые как бы «расщепляют» ген на разные варианты. Этот приводит к невообразимому разнообразию белков при ограниченном наборе генов.

Функционирование генома человека, как и всех млекопитающих, регулируется различными транскрипционными факторами – специальными белками. Эти белки связываются с регуляторной частью гена (промотером) и таким образом регулируют его активность. Одни и те же факторы могут по-разному проявлять себя в разных тканях. У человека есть свои собственные, присущие только ему, транскрипционные факторы. Выявить эти чисто человеческие особенности генома еще только предстоит ученым.

СНП
Существует и еще один механизм генетического разнообразия, который выявился только в процессе прочтения генома. Это сингулярный нуклеотидный полиморфизм, или, так называемые факторы СНП.

Полиморфизмом в генетике называют ситуацию, когда гены одного и того же признака существуют в разных вариантах. Примером полиморфизма, или, другими словами, множественных аллелей, служат группы крови, когда в одном хромосомном локусе (участке) могут находиться варианты генов А, В или О.

Сингулярность по-латыни означает одиночество, что-то единственное. СНП – это изменение «буквы» генетического кода без «последствий для здоровья». Считается, что у человека СНП встречается с частотой 0,1%, т.е. каждый человек отличается от других одним нуклеотидом на каждую тысячу нуклеотидов. У шимпанзе, представляющей собой более древний вид, и к тому же гораздо более гетерогенный, число СНП при сравнении двух разных особей достигает 0,4%.

Но если различия в СНП не сказываются на здоровье особей, то чем они интересны и важны? Во-первых, изучение СНП имеет большое теоретическое значение. Именно они позволяет сравнивать возрасты популяций и определять пути их миграции. Так, например, в мужской половой хромосоме (Y) выделены 22 фактора СНП, анализ которых у 1007 европейцев позволил определить, что 80% европейских мужчин имеют сходный «СНП-паттерн», т.е. «рисунок». Это говорит о том, что тысячи поколений назад 4/5 европейских мужчин имели общего предка!

Но и практическое значение СНП велико. Возможно, не все знают, что сегодня самые распространенные лекарства эффективны не более чем для четверти населения. Минимальные генетические отличия, обусловленные СНП, определяют эффективность лекарств и их переносимость в каждом конкретном случае. Так, у больных диабетом выявили 16 специфических СНП. Всего при анализе 22-й хромосомы определили местоположение 2730 СНП. В одном из генов, кодирующих синтез рецептора адреналина, выявлено 13 СНП, которые могут комбинироватьcя друг с другом, давая 8192 различных варианта (гаплотипа).

Насколько скоро и полно начнет использоваться полученная информация, пока не совсем ясно. Пока же приведем еще один конкретный пример.

Среди астматиков довольно популярно лекарство албутерол, который взаимодействует с указанным рецептором адреналина и подавляет приступ удушья. Однако из-за разнообразия гаплотипов людей лекарство действует не на всех, а некоторым больным оно вообще противопоказано. Это обусловлено СНП: люди с последовательностью букв в одном из генов ТЦТЦЦ (Т–тимин, Ц–цитозин) не реагируют на албутерол, если же концевой цитозин заменен на гуанин (ТЦТЦГ), то реакция есть, но частичная. Для людей же с тимином вместо концевого цитозина в этом участке – ТЦТЦТ – лекарство токсично!

Протеомика
Эта совершенно новая отрасль биологии, изучающая структуру и функции белков и взаимосвязи между ними, названа по аналогии с геномикой, занимавшейся геномом человека. Само рождение протеомики уже объясняет, зачем нужна была программа «Геном человека». Поясним на примере перспективы нового направления.

В далеком 1962 г. вместе с Уотсоном и Криком в Стокгольм были приглашены из Кембриджа Джон Кэндрью и Макс Перутц. Они были удостоены Нобелевской премии по химии за впервые осуществленную расшифровку трехмерной структуры белков миоглобина и гемоглобина, ответственных за перенос кислорода в мышцах и эритроцитах соответственно.

Напомним, что даже в начале 1990-х гг. расшифровка структуры каждого нового белка представляла значительные трудности. Каждый анализ занимал до десятка лет. И хотя сейчас вместо рентгеновских лучей используют ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), однако времени и денег на определение пространственной структуры каждого белка уходит очень много.

Протеомика позволяет ускорить и удешевить эти работы. К.Вентер отметил, что он 10 лет потратил на выделение и секвенирование гена адреналинового рецептора человека, теперь же его лаборатория тратит на это 15 с. Еще в середине 90-х гг. нахождение «адреса» гена в хромосомах занимало 5 лет, в конце 90-х – полгода, а в 2001 г. – одну неделю! Кстати, ускорению определения положения гена помогает информация о СНП, которых сегодня насчитываются уже миллионы.

Вернемся к протеомике. Знание аминокислотных последовательностей и трехмерной структуры определенных белков позволило разработать программы сопоставления генетических последовательностей с аминокислотными, а затем программы предположительного расположения их в трехмерной структуре полипептидов. Знание трехмерной структуры позволяет быстро находить химические варианты молекул, в которых блокирован, например, активный центр, или определять положение активного центра у мутантного фермента.

Известно, что повышение артериального давления вызывается ферментом АСЕ, сокращенное название которого переводится с английского как ангиотензин-конвертирующий фермент. Образующийся под действием фермента ангиотензин воздействует на стенки артерии, что и ведет к гипертонии. Уже относительно давно были найдены блокаторы фермента АСЕ, которые стали продаваться в качестве лекарств от повышенного давления. Однако, эти лекарственные средства оказались малоэффективными.

Анализ генома позволил выделить ген АСЕ-2, который кодирует более распространенный и эффективный вариант фермента. Затем была определена виртуальная структура белкового продукта, после чего подобраны химические вещества, активно связывающиеся с белком АСЕ-2. Так был найден новый препарат против артериального давления, причем за вдвое меньшее время и всего лишь за 200 вместо 500 млн долларов!

Признаемся, что это был пример «догеномного» периода. Теперь же, после прочтения генома, на первый план выходит протеомика, цель которой – быстрее разобраться с тем миллионом белков, которые потенциально могут существовать в наших клетках. Протеомика позволит более тщательно диагностировать генетические отклонения и блокировать неблагоприятное действие мутантных белков на клетку.

А со временем можно будет планировать и «исправление» генов.

Заключенного в клетке человека. Человеческий геном состоит из 23 пар хромосом, находящихся в ядре, а также митохондриальной ДНК. Двадцать две пары аутосом, две половые хромосомы Х и
Y, а также митохондриальная ДНК человека содержат вместе примерно 3,1 млрд пар оснований. У человека мужской пол является гетерогаметным и определяется наличием Y хромосомы. Нормальные диплоидные соматические клетки имеют 46 хромосом.
Секвенирование - это определение нуклеотидной последовательности избранного участка ДНК
Картирование - это создание схемы, описывающей порядок расположения генов на хромосоме
Метод «прогулки по хромосоме» - Метод выделения и анализа нуклеотидных последовательностей (новых генов), фланкирующих известные гены, для которых имеются олигонуклеотидные зонды; после выделения гена с фланкирующими его последовательностями эти последние используются в качестве зондов для выделения новых, прилегающих к ним последовательностей и т.д.; в результате “П.п.х.” с помощью перекрывающихся последовательностей нуклеотидов исследуются неизвестные протяженные участки генома, прилегающие друг к другу
Гибридизация ДНК - образование в опыте двухцепочечной ДНК или дуплексов
ДНК:РНК в результате взаимодействия комплементарных нуклеотидов. Метод гибридизации заключается в следующем: клонированную копию нужного гена помечают радиоактивной или флуоресцентной меткой.
Отмеченный таким образом, фрагмент ДНК называется ЗОНДОМ.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологическая реакция, позволяющая быстро получить большое количество копий конкретного фрагмента ДНК.
Искомый фрагмент может быть частью очень сложной смеси нуклеиновых кислот.
Исходным материалом для ПЦР может быть даже единственная молекула ДНК.
Преимущества: Высокая специфичность; Высокая чувствительность; Возможность диагностики скрытых инфекций; Прямое определение наличия возбудителя; Высокая скорость получения анализа (4-5 часов)
Проблема клонирования человека - проблема этическая в ᴨȇрвую очередь. Человек вторгается в сферу бытия, за которую не ответственен в силу своей природы, что влечет непредсказуемость последствий таких шагов.
Проблемы генотерапии : В обозримом будущем влияние генотерапии ограничено лишь соматическими клетками (не зародышевыми). Трансген должен избирательно попасть в клетки определенной ткани , чему сейчас уделяется существенное внимание. Как только

1.Фундаментальные свойства живых систем. Проявление фундаментальных свойств
живого на основных эволюционно обусловленных уровнях организации жизни.
Фундаментальными свойствами живого являются: 1) Структурная организация; 2)
Отрицательная энтропия; 3) Открытая система; 4) Самообновление,
самовоспроизведение; 5) Раздражимость; 6) Адаптация; 7) Репродукция; 8)
Наследственность; 9) Изменчивость; 10) Индивидуальное развитие (онтогенез); 11)
Филогенетическое развитие; 12) Дискретность и целостность.
Структурная организация. Живые системы способны создавать порядок из хаотичного движения молекул, образуя определенные структуры. Для живого характерна упорядоченность в пространстве и времени. Это комплекс сложных саморегулирующихся процессов обмена веществ, протекающих в строго определенном порядке, направленном на поддержание постоянства внутренней среды - гомеостаза.
Открытая система. Живые организмы - открытые системы, совершающие постоянный обмен веществом и энергией с окружающей средой. При изменении условий среды происходит саморегуляция жизненных процессов по принципу обратной связи, направленная на восстановление постоянства внутренней среды - гомеостаза.
Самовоспроизведение. Самообновление. Время существования любой биологической системы ограничено. Для поддержания жизни происходит процесс самовоспроизведения, связанный с образованием новых молекул и структур, несущих генетическую информацию , находящуюся в молекулах ДНК.
Раздражимость. Все живое избирательно реагирует на внешние воздействия специфическими реакциями благодаря свойству раздражимости.
Адаптация - приспособление организма к внешним условиям в процессе эволюции, включая морфофизиологическую и поведенческую составляющие. Адаптация может обеспечивать выживаемость в условиях конкретного местообитания, устойчивость к воздействию факторов абиотического и биологического характера, а также успех в конкуренции с другими видами, популяциями, особями.
Размножение - присущее всем живым организмам свойство воспроизведения себе подобных, обеспечивающее непрерывность и преемственность жизни.
Наследственность. Молекула ДНК способна хранить, передавать наследственную информацию, благодаря матричному принципу репликации, обеспечивая материальную преемственность между поколениями.
Изменчивость. При передаче наследственной информации иногда возникают различные отклонения, приводящие к изменению признаков и свойств у потомков. Если эти изменения благоприятствуют жизни, они могут закрепиться отбором.
Онтогенез – процесс индивидуального развития организма, проходящий весь жизненный цикл, начиная от зиготы и до смерти.
Филогенез - историческое развитие организмов, или эволюция органического мира; можно говорить и о филогенезе тех или органов.
Дискретность и целостность. Любая биологическая система (клетка, организм, вид и т.д.) состоит из отдельных частей, т.е. дискретна. Взаимодействие этих частей образует целостную систему (например, в состав организма входят отдельные органы , связанные структурно и функционально в единое целое).
2. Профилактика наследственных заболеваний и болезней с наследственным
предрасположением. Пренатальная диагностика, ее методы и возможности.
Пренатальная диагностика --область медицины, которая занимается дородовым выявлением различных патологических состояний плода, в том числе, диагностикой врожденных пороков развития (ВПР) и наследственных заболеваний (НЗ).
Методы пренатальной диагностики:


ультразвуковой скрининг (динамическое наблюдение) развития плода и скрининг сывороточных факторов материнской крови считаются неинвазивными - т.е. не предусматривают хирургического вторжения в полость матки.

Другие же технологии (биопсия хориона или амниоцентез, например) являются инвазивными - т.е. предполагают хирургическое вторжение в полость матки с целью взятия плодного материала для последующего лабораторного исследования.
Биопсия хориона – данный метод проводится до 12 недели беременности. Суть метода: под контролем УЗИ аспирируется очень небольшое количество этой ткани хориона, имеющего плодное происхождение.
Риск осложнений после этой процедуры – 2%.
Кроме хромосомных и некоторых моногенных заболеваний можно определить еще и пол плода.
Процедуру проводят в амбулаторных условиях.
Плацентобиопсия –это малое оперативное вмешательство, позволяющее получить микроскопические кусочки тканей плаценты.
Показание: исключить грубую генетическую патологию плода.
Чаще всего такая необходимость возникает: у женщин старше 35 лет; у женщин, которые уже имеют ребенка с хромосомными аномалиями либо у которых они определялись при ранее возникавших беременностях; при наличии УЗИ-маркеров хромосомных болезней плода; при подтвержденной хромосомной аномалии у одного из родителей или близких родственников; при определении повышенного риска по результатам одного из скрининговых исследований.
Амниоцентез - пункция плодного пузыря с целью получения околоплодных вод.
Амниоцентез проводят обычно на 15-16 неделе беременности. Околоплодная жидкость исследуется на предмет выявления моногенной и хромосомной патологии плода.
Результаты исследования будут не ранее 2-6 недель от амниоцентеза.
Риск осложнений 0,5-1%.
Кордоцентез –пункция сосудов пуповины плода под контролем УЗИ с целью получения крови плода. Выполняют после 20-й недели беременности под наркозом. Взятая из пуповины кровь оценивается цитогенетическим, молекулярно-генетическим и биохимическим методами.
Результат исследования можно получить через 7-10 дней.
Риск прерывания беременности около 2%.
УЗИ-скрининг беременности – это проведение исследования по определенной схеме.
Данный метод диагностики должен проводиться абсолютно каждой женщине, готовящейся стать мамой.
Только качественное УЗИ может с большой степенью достоверности выявить или исключить у плода врожденные пороки развития.
В нашей стране законодательством установлены следующие сроки обязательного УЗИ скрининга, основанные на многолетнем опыте работы
11-13 недель
20-22 недели
30-34 недели
Первый скрининг проводится не ранее 10 и не позже 14 недель беременности. Это продиктовано тем, что данные сроки оптимальны для выявления грубых пороков развития и определенных показателей, настораживающих в плане генетических отклонений и заболеваний.

1. Геном, клонирование, происхождение человека. – Под ред. Л.И. Корочкина. – Фрязино: «Век 2», 2004. – 224 с.

2. Вымершие звери и птицы, которых проще всего клонировать. – Электронный ресурс. – 2013.

3. Андреева, Л.Е., В.З. Тарантул. Трансгенные животные: фундаментальные и прикладные аспекты / Л.Е. Андреева, В.З. Тарантул // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 / Отв. ред. Е.Д.Свердлов. – М.: Наука, 2003. – С. 184 – 217.

4. Клонирование человека. Вопросы этики. – Париж, Изд-во ЮНЕСКО, 2004. – 21 с.

Тема № 4. Современные методы исследования генома

Краткое содержание:

1. Классический подход к расшифровке последовательностей ДНК

2. Принцип высокопроизводительного пиросеквенирования ДНК

3. Достижения и перспективы секвенирования

4. Использование методов биоинформатики в секвенировании

5. История прочтения генома человека

Невозможно представить себе современную биологию (не только молекулярную биологию и биохимию, но и систематику, теорию эволюции, антропологию, медицину) без мегабайтов прочитанных последовательностей ДНК, этой плоти и крови биоинформатики , самой динамично развивающейся области биологической науки. Успех в этой области был достигнут в конце ХХ в. благодаря прорыву в создании технических устройств и технологий расшифровки геномов. Определение последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК получило название секвенирования (от англ. sequence – последовательность), а приборы, предназначенные для этой цели, именуются секвенаторами .

1. Классический подход к расшифровке последовательностей днк

Самый распространенный на сегодняшний день способ секвенирования ДНК - «метод терминации цепи », или «дидезокси метод », разработанный в 70-х гг. прошлого века Фредериком Сэнгером (дважды лауреат Нобелевской премии по химии: за определение аминокислотной последовательности инсулина (1955 г.) и за разработку метода секвенирования ДНК (1980 г.)). Дешевизна, точность, а также сравнительная простота автоматизации делает этот метод своеобразным «золотым стандартом » среди всех существующих способов определения последовательности нуклеотидных остатков ДНК. Так был расшифрован весь геном человека, и именно метод Сэнгера до сих пор является рутинным в повседневной лабораторной практике.

амплифицируются

Вначале фрагменты ДНК, последовательность которых предстоит определить, многократно копируются (амплифицируются ), затем нарезаются на короткие куски, которые служат матрицей для синтеза комплементарных цепей ДНК. Синтез в общих чертах напоминает процесс копирования ДНК в живой клетке.

Особенность метода заключается в использовании химически модифицированных разновидностей четырех дезоксирибонуклеотидов , составляющих цепи ДНК. Каждая разновидность «помечена» флуоресцентной молекулой-маркером, на жаргоне «краской». Короткий фрагмент ДНК, называемый затравкой, или праймером , инициирует синтез ДНК в определённой точке цепи ДНК-матрицы. Синтезирует комплементарную цепь особый фермент - ДНК-полимераза . При этом флуоресцентно меченные разновидности нуклеотидов, которые присутствуют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи. (Все дело в том, что видоизмененные нуклеотиды не имеют той самой химической группы, к которой должен присоединяться следующий нуклеотид для продолжения цепи.) В результате получается смесь, содержащая полный набор ново-синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы.

Современные автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие капилляры, наполненные гелем. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле по капилляру под действием электрического поля. (Фрагменты ДНК - по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле от «минуса» к «плюсу».) Процесс, называемый капиллярным электрофорезом , настолько эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. По мере того как фрагмент появляется, он освещается лазером, что заставляет светиться меченый нуклеотид на его конце. Компьютер определяет разновидность этих нуклеотидов по цвету вспышки и регистрирует последовательность их появления, складывая «буквы» (нуклеотиды) в «текст» (последовательность ДНК). В случае расшифровки целого генома так нарабатываются миллиарды коротких «текстов», которые поступают в специальную программу, запускаемую на суперкомпьютерах. Программа находит места перекрывания «текстов» и, располагая их в нужном порядке, выстраивает полную последовательность генома.

Большинство новых технологических разработок направлено на миниатюризацию , мультиплексирование (в данном случае, параллельное соединение низкопроизводительных блоков системы для повышения общей производительности) и автоматизацию процесса секвенирования. Все они могут быть разделены на два класса. Первый объединяет методы «секвенирования синтезом», в которых основания определяются по мере того, как они встраиваются в растущую цепь ДНК.

Ко второму классу относятся технологии расшифровки последовательности оснований единичной молекулы ДНК. Некоторые из них достаточно экзотичны - как, например, чтение нуклеотидных остатков ДНК электронным или оптическим способом по мере того, как молекула «протискивается» через нанопору . Длинный перечень улучшений системы капиллярного электрофореза в сочетании с возрастающей автоматизацией и усовершенствованием программного обеспечения позволили снизить стоимость секвенирования в 13 раз с тех пор, как первые автоматические секвенаторы появились в 90-е годы.

Но все это выглядит несколько бледно на фоне возможностей нового метода секвенирования синтезом - изощрённого варианта пиросеквенирования, разрабатываемого и внедряемого компанией 454 Life Sciences.

2. Принцип высокопроизводительного пиросеквенирования ДНК

Технология, разработанная компанией 454 Life Sciences, называется пирофосфатным секвенированием, или пиросеквенированием . Сама идея пиросеквенирования, надо сказать, не нова: она возникла ещё в начале 90-х годов прошлого века, но опубликованный тогда метод не сумел вытеснить традиционный дидезокси метод Сэнгера. Однако разработчики из 454 Life Sciences дополнили его возможностями современных нанотехнологий, и количество перешло в качество. Поэтому, точнее будет назвать метод «пиросеквенированием ДНК в плотно упакованных пиколитровых реакторах».

Скорость является одним из главных преимуществ нового метода секвенирования. Название метода заимствовано у знаменитого на Западе автомобиля Chevrolet Chevelle SS 454 1970-го года с двигателем мощностью 360 лошадиных сил.

Весь геном, все его молекулы ДНК, случайным образом фрагментируются на кусочки по 300–500 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагмента разделяются, к каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид-«адаптер », который позволяет отдельным цепям налипать на пластиковые бусинки . (Последовательность этого олигонуклеотида позволяет позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу.) При этом смесь разъединённых на комплементарные цепи фрагментов разбавляют таким образом, что каждая бусинка получает лишь по одной (!) индивидуальной цепи.

Каждая бусинка оказывается заключённой в капельку, окруженную маслом и содержащую смесь для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая и проходит отдельно в каждой капельке эмульсии (так называемая эмульсионная ПЦР , эПЦР). Это приводит к «клональной амплификации» цепей ДНК, а говоря по-русски, к тому, что на поверхности бусинки удерживается уже не одна, а около 10 млн копий («клонов») уникальной ДНК-матрицы.

Далее эмульсия разрушается, вновь двуцепочечные фрагменты ДНК (образовавшиеся в ходе ПЦР) разделяются, и бусинки, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы, помещаются в лунки «предметного стекла » - слайда особой конструкции. Каждая лунка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор» , в котором и будет происходить реакция секвенирования.

Слайд представляет собой срез блока , полученного путём нескольких циклов вытягивания и сплавления оптических волокон. В результате каждого цикла диаметр индивидуальных волокон уменьшается по мере того, как волокна формируют пучки шестигранной упаковки увеличивающегося поперечного диаметра. Каждое волокно имеет сердечник диаметром 44 мкм, окружённый 2–3 мкм слоем оболочки. Затем сердечники вытравливаются, и в результате получаются лунки ≈55 мкм глубиной, с расстоянием ≈50 мкм между центрами соседних лунок. Объём таких «реакторов» - 75 пиколитров; плотность размещения на поверхности слайда - 480 лунок на квадратный миллиметр. Каждый слайд несёт около 1,6 миллионов лунок, в каждую из которых попадает одна (!) бусинка с ДНК-матрицей. Слайд помещается в проточную камеру таким образом, что над отверстиями лунок создаётся канал высотой 300 мкм, по которому в лунки поступают необходимые реактивы.

Доставляемые в проточную камеру реактивы текут в слое, перпендикулярном оси лунок. Такая конфигурация позволяет одновременно осуществлять реакции на бусинках, несущих ДНК-матрицы, внутри отдельных лунок. Добавление и удаление реагентов и продуктов реакции происходит за счёт конвекционного и диффузионного переноса. Время диффузии между потоком и лунками составляет около 10 секунд и зависит от высоты проточной камеры и глубины лунок. Глубина лунок тщательным образом рассчитана исходя из следующих соображений:

1. Лунки должны быть достаточно глубокими, чтобы бусинки, несущие ДНК-матрицу, не выскакивали из них под действием конвекции.

2. Они должны быть достаточно глубокими, чтобы исключить диффузию продуктов реакции из лунок, где имело место включение нуклеотида, в лунки, где включения не произошло.

3. Лунки должны быть мелкими настолько, сколько требуется для осуществления быстрой диффузии нуклеотидов в лунку и быстрого вымывания оставшихся нуклеотидов и продуктов реакции в конце каждого цикла, что, в свою очередь, необходимо для обеспечения высокой продуктивности секвенирования и снижения расходов реактивов.

Помимо бусинок с ДНК-матрицей, в каждую лунку «насыпают» ещё бусинок помельче - каждая с «сидящими» на её поверхности (иммобилизованными ) ферментами , необходимыми для пирофосфатного секвенирования. Нуклеотиды (одного вида за раз) и другие реактивы, необходимые для реакции секвенирования, подаются последовательно в проточную камеру, куда помещается слайд.

Каждый раз, когда определённый нуклеотид встраивается в растущую цепь ДНК в какой-нибудь из лунок, в ней высвобождается молекула пирофосфата , которая, в свою очередь, является необходимым предшественником компонента другой ферментативной реакции. Её катализирует особый фермент, люцифераза светлячка Photinus pyralis. Но для её осуществления необходим аденозинтрифосфат (АТФ). Новообразованный пирофосфат превращается в лунке в АТФ под действием ещё одного фермента - АТФ-сульфурилазы . И тогда люцифераза окисляет люциферин до оксилюциферина, а эта реакция сопровождается хемилюминесценцией - по-простому, маленькой вспышкой света. Дно слайда находится в оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, подключённым к прибору с зарядовой связью (CCD-сенсор, charge coupled device ). Это позволяет регистрировать излучаемые фотоны со дна каждой индивидуальной лунки, в которой произошло встраивание известного нуклеотида. Общая схема пиросеквенирования дана на рис. 1.

Связывая зарегистрированные от каждой лунки вспышки с типом нуклеотида, присутствующего в проточной камере в данный момент времени, компьютер последовательно отслеживает рост цепочек ДНК в сотнях тысяч лунок одновременно. Время, необходимое для протекания ферментативной реакции, производящей детектируемую «вспышку», составляет порядка 0,02–1,5 секунд. Таким образом, скорость реакции определяется скоростью массопереноса, что оставляет место для улучшений за счёт ускорения доставки реактивов. После поступления в проточную камеру каждого нуклеотида, она промывается раствором, содержащим фермент апиразу . Таким образом, перед тем как «запустить» в камеру следующий нуклеотид, из всех лунок удаляются любые нуклеотиды, остававшиеся там от предыдущего раунда.

Включение того или иного нуклеотида детектируется в результате высвобождения неорганического пирофосфата и последующего излучения света. Определить лунки, содержащие бусинки с матричной цепью ДНК, можно, прочитав «последовательность - ключ» адаптерного олигонуклеотида, пришитого к началу каждой ДНК-матрицы. Из регистрируемого сигнала вычитается уровень фона, затем сигнал нормализуется и корректируется.

Интенсивность нормализованного сигнала для каждой конкретной лунки во время поступления в проточную камеру определённого нуклеотида пропорциональна числу встроенных нуклеотидов. Линейность зависимости сохраняется для гомополимеров длиной как минимум в восемь нуклеотидов. При таком секвенировании синтезом очень небольшое число ДНК-матриц на каждой бусинке теряет синхронизм , т. е. вырываются вперёд или начинают отставать от других матриц. Исправление таких сдвигов необходимо, поскольку потеря синхронизма создаёт кумулятивный эффект , сильно снижающий качество прочтения при увеличении его длины. С учетом этого, сотрудники компании 454 разработали особый алгоритм, позволяющий оценивать и вносить поправки на «перелёт» и неполную достройку цепи, происходящие в отдельных лунках. Высокая точность расшифровки последовательности достигается тем, что система осуществляет многочисленное прочтение одного и того же фрагмента, что позволяет построить единую обобщённую (так называемую консенсусную ) последовательность.

Отдельные прочтения (риды – от англ. reаd, читать) одного и того же участка ДНК выравниваются относительно друг друга исходя из интенсивности сигналов в момент протекания через камеру того или иного нуклеотида, а не на основе последовательности этих прочтений. Затем соответствующие сигналы усредняют, и только тогда записывают полученную последовательность. Такой подход значительно улучшает качество расшифровки последовательности и предоставляет возможность оценки её качества.

В 2005 г. учёные из 454 Life Sciences, используя свою технологию, сумели расшифровать состоящий из 600 тысяч нуклеотидов геном бактерии Mycoplasma genitalium с точностью 99,4%, а также состоящий из 2,1 млн нуклеотидов геном Streptococcus pneumoniae .

Рисунок 1 - Схема пиросеквенирования. А - ДНК фрагментируется, к фрагментам пришиваются олигонуклеотиды-«адаптеры»; полученные двуцепочечные молекулы ДНК разделяются на две комплементарные цепи. Б - Одноцепочечные молекулы ДНК прикрепляются к бусинкам в условиях, стимулирующих попадание лишь одной молекулы на бусинку. Отдельные бусинки заключаются в капли реакционной смеси, окруженные маслом. Количество молекул на бусинке увеличивается в миллионы раз в результате эмульсионной полимеразной цепной реакции (эПЦР). В - Эмульсия разбивается, и цепи ДНК-фрагментов, образовавшиеся в результате эПЦР, разделяются. Бусинки, несущие на своей поверхности миллионы одноцепочечных копий первоначального фрагмента ДНК, помещаются в лунки оптико-волоконного слайда, по одной в каждую лунку. Г - В каждую лунку добавляются бусинки поменьше, несущие на своей поверхности ферменты, необходимые для пиросеквенирования. Д - Микрофотография эмульсии, изображающая «пустые» капли и капли, содержащие бусинки с ДНК-матрицей. Толстая стрелка указывает на 100-мкм каплю, тонкая - на 28-мкм бусинку. Е - Микрофотография фрагмента оптико-волоконного слайда, полученная при помощи сканирующего электронного микроскопа. Видны оболочки оптических волокон и пустые лунки

В статье, в которой впервые был представлен и опробован новый метод, сообщается, что весь геном Mycoplasma genitalium был прочтён за один раз! Сначала весь геном был фрагментирован и превращён в библиотеку кусочков ДНК, как описано выше (труд одного человека на протяжении 4-х часов). После проведения эмульсионной ПЦР и помещения полученных бусинок с ДНК-матрицами на 60 мм 2 слайд (на что одному сотруднику потребовалось 6 часов), процесс завершился 4-х часовой автоматической работой инструмента, состоящей из 42 циклов.

В результате сборки прочитанных последовательностей (каждый около 108 пар оснований) было получено 25 отдельных непрерывных фрагментов, так называемых контигов (от англ. contigious –соприкасающийся), средней длиной в 22,4 тысяч пар оснований. Эти фрагменты покрыли около 96,54% всего генома микоплазмы. Из оставшихся непрочтёнными 4,6% генома, 3% приходились на неразрешимые повторы . Таким образом, за один раз было отсеквенировано 99,5% уникальной последовательности генома.

3. Достижения и перспективы секвенирования

Хотя первая версия инструмента от компании 454 Life Sciences легко могла заменить более 50 капиллярных секвенаторов Applied Biosystem 3730XL по цене в шесть раз меньшей, реакция научного сообщества была на удивление прохладной. Вместо того чтобы принять новую технологию и начать использовать её неисчерпаемый потенциал, многие учёные, привыкшие к использованию метода Сэнгера, заговорили о таких проблемах, как точность расшифровки, длина отдельных прочтений, стоимость инфраструктуры... А кто-то просто восставал против необходимости работать с большими массивами информации, производимыми с использованием новой технологии.

Большинство критиков, однако, не заметили, что множество препятствий, стоящих на пути метода секвенирования следующего поколения, преграждали на первых порах путь и методу Сэнгера. Тогда длина прочтений составляла всего 25 пар оснований, и достигла 80 только после появления терминирующих дидезокси-нуклеотидов Фреда Сэнгера. Технология «секвенирования синтезом», основанная на выделении пирофосфата, изначально позволяла прочитывать отрезки длиной не более 100 нуклеотидов. Спустя 16 месяцев на биотехнологическом рынке, этот показатель был улучшен до 250 пар оснований. Последние разработки позволяют считывать уже около 500 пар оснований, приближая новый метод к методу Сэнгера с его ≈1000 нуклеотидами.

Другим важным фактором, помимо длины отдельных прочтений, является число прочтений , производимое в результате одного «прогона » секвенатора, нормированное на стоимость такого «прогона». Этот вопрос хорошо решается конкурентами 454 Life Sciences, системы которых производят в десять раз больше прочтений, платя за это укорочением их длины, составляющей всего 35 (или меньше) нуклеотидов. Сегодня на рынке существует три коммерческих системы нового поколения для секвенирования ДНК:

Roche (454) GS FLX Genome Analyzer, распространяемый Roche Applied Sciences. (Компания 454 LIfe Sciences выкуплена гигантом Roche Diagnostics в марте 2007 г. за 154,9 млн. долларов, но продолжает оставаться независимым подразделением);

Секвенатор Illumina Solexa 1G и

Наиболее свежая система SOLiD от Applied Biosystems.

Другие системы для расшифровки ДНК, которые уже появились на рынке, относятся к «третьему поколению » и основываются на анализе одиночных молекул. Они разрабатывались компаниями VisiGen и Helicos.

И хотя прочтение бактериального генома за раз было впечатляющим достижением, поначалу не было ясно, какие биологические задачи , недоступные старому доброму методу Сэнгера, можно будет решать, взяв на вооружение новый метод пиросеквенирования. И действительно, первые проекты с участием инструмента Roche 454 GS20 заключались лишь в «перечитывании» уже расшифрованных бактериальных геномов и подкреплении дополнительными данными уже идущих больших «Сэнгеровских проектов». В то же время исследования в области метагеномики , помимо работы с огромными массивами данных, порою бóльшими, чем геном человека, страдали от искажений, вносимых на стадиях конструирования библиотек и клонирования фрагментов для секвенирования.

В этом смысле технология 454, сочетающая эПЦР и пиросеквенирование, обладает неоспоримым преимуществом перед методом Сэнгера. Эмульсионная ПЦР позволяет амплифицировать без всяких предпочтений единичные молекулы ДНК, заключая их в капельку эмульсии и устраняя конкуренцию со стороны других ДНК-матриц за ограниченное число ДНК-полимераз. Пиросеквенирование, в свою очередь, осуществляет параллельное прочтение этих матриц со световым сигналом на выходе, который может считываться компьютером. Первые подобные исследования, опубликованные в 2006 году, показали необыкновенную гибкость метода нового поколения, использованного при изучении микробного многообразия подземных экосистем глубокой шахты, глубоководных морских экосистем, морских вирусных «сообществ» («виромов ») в нескольких океанах.

Интересное исследование, сочетающее в себе метагеномный анализ и «ДНК-палеонтологию », было проведено в конце 2005 г. Одного запуска инструмента Roche (454) GS20 было достаточно для анализа 13 млн. пар оснований последовательности генома 28 000-летнего мамонта . Эта работа проложила дорогу для технически более трудного проекта расшифровки генома неандертальца . Трудность такого проекта состоит в том, что количество выделяемой из образцов костей древней ДНК неандертальца составляет всего лишь 5% от количества, получаемого из «свежего материала». Следовательно, секвенировать приходится в 20 раз дольше, чем это необходимо для генома современного человека. Кроме того, вклад разрушения ДНК в образцах, сохраняемых при умеренных температурах, в сочетании с ошибками, присущими новому методу пиросеквенирования, часто превосходит уровень различия, установленный для геномов неандертальца и современного человека. Поэтому утверждать, что полученная последовательность действительно древняя, а не случайно попавшая в препарат современная ДНК, значительно легче в случае с мамонтом - современные слоны, в отличие от людей, не часто встречаются в лабораториях. Для того чтобы получить настоящую последовательность древнего генома млекопитающего, необходимо провести множество раундов прочтения каждого участка генома, а также удостовериться в происхождении прочитанных участков.

Вместе с прорывом в области секвенирования сложных смесей ДНК, такие проекты сделают возможным изучение любой экосистемы на планете на уровне последовательностей ДНК. Это откроет доступ к флоре и фауне 100-тысячелетней давности - возможности, превосходящие самые смелые ожидания совсем недалекого прошлого.

На клеточном уровне секвенирование нового поколения (здесь и далее речь идёт не только о пиросеквенировании, но и о других новых методах секвенирования синтезом) впервые позволяет учёным идентифицировать мутации в любом организме для всего генома. Так были найдены аллели, отвечающие за устойчивость к антибиотику у Mycobacterium tuberculosis , а также идентифицированы все мутации в геноме размером в 9 млн пар оснований у штамма бактерии, эволюционировавшей на протяжении 1000 поколений. Эти ранние попытки не только продемонстрировали способность новой технологии обнаруживать мутации и ошибки в опубликованных научных статьях, но и связанные с её использованием трудности, такие как ошибки прочтения гомополимерных последовательностей при пиросеквенировании (454) или быстрое уменьшение качества прочтения ближе к 3’-концу последовательности в системах с короткой длиной индивидуальных прочтений (Solexa или SOLiD от Applied Biosystem).

Раньше для преодоления этих трудностей данные, полученные пиросеквенированием, дополняли информацией, полученной классическим сэнгеровским путём. Но поскольку стоимость и затраты, требуемые сэнгеровской составляющей эксперимента, остаются отталкивающе высокими, многие лаборатории сегодня полагаются только на методы нового поколения, обычно сочетая относительно длинные прочтения пиросеквенирования с короткими, но дешевыми (а значит, и многочисленными) прочтениями, осуществляемыми системами Solexa и SOLiD. Такое сочетание различных платформ позволяет производить независимую оценку качества их работы, а также проверять эталонные последовательности, хранящиеся в общественных базах данных.

Получение большого количества последовательностей ДНК из различных близкородственных организмов движет вперед и развивает подход, названный повторным секвенированием (resequencing), в котором работа с последовательностями ведётся иначе, чем при сборке свежесеквенированного генома. При повторном секвенировании сборка направляется уже имеющейся под рукой эталонной последовательностью, и поэтому требует значительно меньшего покрытия (8–12-ти кратного), чем при сборке генома de novo (25–70-ти кратного). Этот подход был применён в работе по расшифровке 10 митохондриальных геномов млекопитающих, которая сделала возможными исследования в области генетики популяций, основанные не на коротких отрезках последовательности, а на полных геномах митохондрий. В настоящий момент многочисленные проекты по расшифровке микробных геномов ведутся не только для расширения списка доступных геномов, но и для проведения будущих сравнительных исследований, сопоставляющих генотип и фенотип организма на геномном уровне.

Далеко может продвинуться также и работа по изучению организмов, которые не стоят в планах по геномному секвенированию - благодаря возможностям новых методов секвенирования напрямую расшифровывать последовательности транскриптов (точнее, кДНК - ДНК-копий матричных РНК) в клетке. Изучение транскриптов посредством прямого секвенирования обладает рядом преимуществ перед методом гибридизации на ДНК-микрочипах. Главное здесь то, что секвенирование не требует никаких знаний о геномной последовательности организма a priori , поскольку последовательность транскрипта может быть немедленно сравнена с эталонной последовательностью близкородственного вида из базы данных, используя стандартные алгоритмы биоинформатики. Знание последовательностей транскриптов может в корне изменить исследования организмов, геномы которых сегодня не стоят в очереди на расшифровку, а в некоторых случаях никогда там и не окажутся. Первые работы в этой области показали, что существует возможность сопоставлять последовательности (кДНК и геномные, соответственно) двух таких далёких друг от друга видов, как бобовое Meticago truncatula и растение-эталон Arabidopsis thaliana . Также было обнаружено множество не описанных ранее транскриптов кукурузы Zea mays .

Прямой анализ транскриптов поможет обойти проблему, которую ставят перед учёными организмы с непомерно большими геномами. Несмотря на успешно проведённые проекты по расшифровке вирусных, бактериальных и больших геномов млекопитающих, метод Сэнгера оставил задачу по расшифровке геномов полиплоидных растений своим преемникам. Эти гигантские геномы, частенько принадлежащие важным хозяйственным растениям (например, геном пшеницы составляет 16 млрд пар оснований), делали все предыдущие попытки по расшифровке бесплодными. Однако перспектива дешёвого секвенирования экспрессируемых участков генома (то есть транскриптов) позволяет надеяться на успешное изучение геномов таких растений хотя бы на функциональном уровне.

И наконец, новые методы секвенирования имеют практическое применение и в медицине. Например, в генетике раковых заболеваний, специфические раковые аллели могут быть отслежены в тканях посредством высокопроизводительного секвенирования геномной ДНК в тех случаях, когда метод Сэнгера терпит поражение. И здесь большим преимуществом нового метода оборачивается многократное прочтение последовательности.

Несмотря на то, что новые методы секвенирования ДНК уже стимулировали большое количество всевозможных исследований, осуществление которых было невозможно ещё в недалёком прошлом, учёным и инженерам, занимающимися разработкой этих технологий - а равно как и компаниям, продвигающим эти технологии на рынке, - предстоит многое сделать для её улучшения. Прежде всего, снизить стоимость . Уменьшение цены на один-два порядка необходимо для осуществления надежд на персональную геномику , цель которой - повторное секвенирование индивидуальных геномов по цене, не превышающей 1000 долларов. В дополнение к этому, снижение процента ошибок будет также горячо приветствоваться - не только для методов следующего поколения, но и для метода Сэнгера, который будет продолжать вносить вклад и в обозримом будущем. Возможно, появятся искусственно изменённые специализированные ДНК -полимеразы , предоставляющие информацию о последовательности ДНК в виде испускаемого светового сигнала. По мере того, как стоимость технологий будет снижаться, количество накапливаемой информации будет расти лавинообразно, что может создать «узкое место» в исследованиях. Поэтому часть усилий по разработке новых технологий секвенирования необходимо направить на развитие биоинформатики .